前沿 | crispr代谢基因筛选发现atm激酶和keap1可作为肿瘤靶向治疗的靶点-4188云顶集团

近十年以来，靶向肿瘤细胞dna损伤反应的异常或缺失在癌症治疗中取得了有效进展。其中，parp1抑制剂在brca1突变患者中取得的成功加速了其他dna修复或复制应激（replication stress）靶向抑制剂的研究【1】。目前，靶向dna损伤反应相关的atm激酶，dna-pk激酶，atr激酶等的抑制剂正处于临床试验。当发生dna双链断裂后，atm激酶能够通过磷酸化组蛋白h2ax等调节dna同源重组修复和非同源连接修复。但值得注意的是， atm激酶在代谢中也发挥着重要的作用，如氧化还原应激，戊糖磷酸途径的调节等等【2-3】。具体来讲，atm激酶可通过磷酸化hsp27，调节戊糖磷酸途径中的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（g6pd）的活性，从而调节nadph的生成【4】。另外， atm激酶可通过磷酸化转录因子nrf1调节细胞核内线粒体基因的表达，从而调节atp的合成【5】。因此，此前的atm激酶抑制剂临床前研究中出现的耐药性，可能是因为癌细胞代谢途径的重编程（metabolic reprogramming）。

近日，来自nih的prof. weyemi研究组在pnas杂志发表了研究成果crispr metabolic screen identifies atm and keap1 as targetable genetic vulnerabilities in solid tumors（博士生李浩健为第一作者）。

该研究为了揭示导致atm抑制剂耐药性的代谢途径，采用crispr screen筛选三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231中可能造成dna损伤响应激酶ataxia-telangiectasia-mutated（atm）抑制剂耐药性的代谢相关基因。筛选结果发现，kelch-like ech-associated protein 1（keap1）的缺失能够使癌细胞对atm抑制剂更加敏感（图1a）。研究者进一步通过动物实验验证了keap1敲除和同时抑制atm激酶可导致合成致死。首先，研究组采用小鼠尾部静脉注射癌细胞的方法建立了基于mda-mb-231细胞的免疫缺陷小鼠（nod scid gamma）癌症转移模型，该模型可通过ivis活体成像观察肿瘤在小鼠中的进展。当肿瘤在小鼠肺部形成后，研究者通过给小鼠口服atm激酶抑制剂azd0156或azd1390的方式给药。研究者观察到相比于keap1野生对照组，keap1敲除组细胞在给药后，在肺中的进展显著降低（图1b-c）。在停止给药后，接受atm激酶抑制剂治疗的小鼠存活率显著提高（图1d）。给药7周后的小鼠肺部组织h&e染色显示keap1敲除组的肿瘤在给药后显著降低（图1e）。此外，由于keap1在非小细胞肺癌中的突变率高达15.8%，研究者采用非小细胞肺癌细胞系nci-h1299皮下注射建立免疫缺陷小鼠的肿瘤模型。利用该模型，研究者发现当结合keap1敲低和口服给药时，小鼠的皮下肿瘤体积和重量显著下降（图1f）。

图1. 体外和体内实验验证 atm激酶和keap1蛋白可作为癌症治疗的靶点。

在体外和体内实验验证了atm和keap1的合成致死现象之后，背后的机制也逐渐浮出水面。keap1是泛素连接酶cullin3的底物识别的适配器，其主要的底物为nrf2蛋白，而nrf2作为转录因子控制着超过200个与细胞氧化还原应激相关的解毒酶和抗氧化酶。当keap1被敲除时，nrf2泛素化水平降低，导致下游的基因被转录激活。nrf2通路成员之一的溶质载体家族 7 成员 11基因（slc7a11），是胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，能够促进细胞的胱氨酸的摄取，从而增加细胞中的谷胱甘肽的合成。近年来研究表明，slc7a11高表达癌细胞在摄取大量胱氨酸，并同时缺失nadph后积累二硫化物应激（disulfide stress），从而导致细胞死亡【6-7】。与之相应的，研究者发现在keap1敲除后， slc7a11蛋白水平得以激活，而当进一步抑制atm激酶活性时，细胞中的nadph含量则开始下降，从而导致反应细胞中二硫化物应激水平的gssg含量亦显著上升以及gsh/gssg比例下降。当研究人员用还原剂tcep处理细胞去除二硫键时， gsh/gssg水平和细胞存活率得到明显回升。由于tcep处理只能部分恢复细胞的存活率，细胞内可能存在其他的致死机制。但当抑制atm激酶时，研究人员并未发现keap1敲除细胞中的组蛋白h2ax磷酸化与wt细胞存在显著差异，而且抑制atr激酶和dna-pk激酶与keap1敲除亦不存在合成致死。因此，该研究中keap1敲除和抑制atm激酶的合成致死的机制可能为slc7a11激活与nadph水平下降导致的二硫化物应激（图2），而非dna损伤的累积或dna修复通路的异常。

图2. 靶向atm激酶与keap1蛋白的合成致死机制

综上所述，该研究发现了atm激酶和keap1蛋白可作为癌症治疗的靶点，为癌症组合治疗提供了新的思路。keap1在所有癌症中的突变率在3.93%，尤其在非小细胞肺癌中的突变率为15.8%，本研究或为atm激酶抑制剂在这些keap1突变或nrf2通路激活的肿瘤中的应用提供依据。

参考文献

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（来源：bioartmed）